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單增李斯特菌檢測方法的改進(jìn)

更新時間:2019-05-09  |  點擊率:1701

在熟肉制品,即食生肉制品、干酪、再制干酪以及飼料中,常需檢查單增李斯特菌的存在,因為這些地方也是。李斯特菌屬有七個菌種,其中單增李斯特菌為致病菌,和人類關(guān)系為密切。但單增李斯特菌的檢驗較為費(fèi)時,前期增菌、分離外,后期還要做鑒定。目前,李斯特菌顯色培養(yǎng)基已得到普遍應(yīng)用,并發(fā)現(xiàn)優(yōu)于PALCAM平板,因為后者無法區(qū)分是單增李斯特菌與英諾克李斯特菌,但前者可以。但目前市面上大多數(shù)的李斯特菌顯色培養(yǎng)基也存在不足,它在分離鑒別出單增李斯特菌的同時,無法區(qū)分出單增李斯特菌與伊氏李斯特菌,也就是說,二者菌落形態(tài)均*相同。

 

實際在檢測單增李斯特菌的過程中,曾有新疆疾控中心的人員發(fā)現(xiàn),單增李斯特氏菌與伊氏李斯特氏菌和英諾克李斯特氏菌誤判現(xiàn)象突出2。這三種常易混淆的李斯特菌在葡萄糖、麥芽糖、MR-VP、甘露醇、七葉苷方面的生化反應(yīng)均一致,溶血反應(yīng)可區(qū)分英諾克與單增。木糖、鼠李糖反應(yīng)可區(qū)分伊氏與單增。但溶血反應(yīng)對操作技巧要求較高,同時,木糖、鼠李糖反應(yīng)也包括在生化鑒定試劑條中,容易導(dǎo)致重復(fù)操作,比較耗時。而要進(jìn)行生化試劑條的鑒定,還需挑菌落后進(jìn)行純培養(yǎng)。

 

在這里,筆者給出一些不同的方案,可省卻后續(xù)復(fù)雜的鑒定步驟,供有關(guān)人員參考。一是在二次增菌后,直接使用一款單增李斯特菌驗證培養(yǎng)基(HiMedia生產(chǎn),貨號MV1552)來分離鑒別。該培養(yǎng)基是依據(jù)磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(PIPLC)活性和α-甲基-D-甘露糖苷的發(fā)酵。磷脂酶C是一種重要的毒力因子,只有單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌具有。單增和伊氏李斯特菌水解培養(yǎng)基中的底物,菌落周圍產(chǎn)生不透明的光暈。單增和伊氏的鑒別是通過α-甲基-D-甘露糖苷的發(fā)酵。單增為陽性,菌落有黃色光暈。伊氏則為陰性。該培養(yǎng)基含有鼠李糖,酚紅為指示劑。其培養(yǎng)反應(yīng)如下:

 

 

圖中標(biāo)號分別為1. 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、2. 伊氏李斯特菌、3. 英諾克李斯特菌、4. 斯氏李斯特氏菌

第二個方案是采用國標(biāo)推薦的李斯特菌顯色培養(yǎng)基(可使用HiMedia生產(chǎn)的,貨號MV1540,符合國標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn),質(zhì)量可靠,*同類進(jìn)口產(chǎn)品,可降低檢測成本),培養(yǎng)反應(yīng)如下:

 

 

但該類顯色培養(yǎng)基無法區(qū)分單增與伊氏李斯特菌,進(jìn)一步鑒別可直接使用李斯特菌生化鑒定試劑盒(內(nèi)含12種生化反應(yīng),HiMedia生產(chǎn),貨號KB0012A)。該試劑盒已包含木糖和鼠李糖的發(fā)酵反應(yīng)。產(chǎn)品外形如下圖:

 

 

 

如不想用生化鑒定試劑盒,可用另一款改良型李斯特菌顯色瓊脂(貨號M1417),它可區(qū)分單增與伊氏李斯特菌,如下圖:

 

35-37°C 培養(yǎng)24-48小時后,單增李斯特菌(左)——藍(lán)綠色菌落,帶黃色光暈。伊氏李斯特菌(右)——藍(lán)綠色菌落,無黃色光暈。但要注意,這款顯色培養(yǎng)基無法區(qū)分單增與英諾克李斯特菌。如果使用一款顯色培養(yǎng)基同時區(qū)分單增、伊氏和英諾克,還可采用單增李斯特菌快速鑒別瓊脂(貨號M1924)。其培養(yǎng)反應(yīng)如下圖所示:

 

 

其具體菌落特征如下:

有機(jī)體(ATCC)

接種(CFU)

生長

菌落顏色

鼠李糖發(fā)酵

PIPLC活性

枯草芽胞桿菌(6633)

≥103

抑制

   

白色念珠菌(10231)

≥103

抑制

   

大腸桿菌(25922)

≥103

抑制

   

英諾克李斯特菌(33090)

50-100

旺盛

藍(lán)綠色

(+)黃色背景

(-)

綿羊李斯特菌(19119)

50-100

旺盛

藍(lán)綠色

(-)

(+)菌落有不透明光環(huán)

單增李斯特菌(19118)

50-100

旺盛

藍(lán)綠色

(+)黃色背景

(+)菌落有不透明光環(huán)

綠膿桿菌(27853)

≥103

抑制

   

 

 

參考文獻(xiàn)

1. 蘇靜  于烽  劉艷  遠(yuǎn)雪梅  馬鑫. 單增李斯特氏菌國家標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法的驗證與探討. 疾病預(yù)防控制通報. 2015-06-24

 

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