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qPCR檢測支原體方法略述

更新時(shí)間:2020-11-09  |  點(diǎn)擊率:858

和PCR比起來,qPCR不用跑膠,實(shí)時(shí)監(jiān)測擴(kuò)增狀況,操作更為便捷。下面以德國MB Venor®GeM支原體檢測試劑盒(qPCR一步法)Venor®GeM qOneStep)為例,略述檢測原理和過程。

 

   該試劑盒包括4管試劑,其中2管分別為緩沖液和PCR水,另2管為主要試劑。1管即mix,含引物、核苷酸、聚合酶、熒光素標(biāo)記的探針和內(nèi)部擴(kuò)增對(duì)照。另1管為陽性對(duì)照,均為凍干粉。

 

它通過擴(kuò)增高度保守的rRNA操縱子,或者更準(zhǔn)確地說,擴(kuò)增支原體基因組中的16S rRNA編碼區(qū),可以特異性地檢測支原體。在520nm(FAMTM通道)檢測支原體特異性擴(kuò)增片段。在610nm(HEXTM通道)檢測內(nèi)部擴(kuò)增對(duì)照的擴(kuò)增。它能特異性檢測所有導(dǎo)致細(xì)胞污染的柔膜體物種。真核DNA不會(huì)被擴(kuò)增。通過內(nèi)部對(duì)照,可檢測PCR抑制劑的存在或不正確的DNA提取引起的假陰性結(jié)果。樣本為細(xì)胞培養(yǎng)上清液。檢測程序可在3小時(shí)內(nèi)完成。

在檢測前,樣本需要一定的制備。具體是將100μl細(xì)胞培養(yǎng)上清液轉(zhuǎn)移至無菌的1.5 ml反應(yīng)管中。關(guān)上蓋子扣緊。將樣品在95°C下孵育5分鐘。以大速度短暫離心樣品(15秒)以沉淀任何細(xì)胞碎片。然后可直接取2μl上清液進(jìn)行qPCR。

 

qPCR反應(yīng)體系一共是25ul,其中樣本2ul,其余是master mix。注意設(shè)置陽性對(duì)照、陰性對(duì)照(無模板對(duì)照)。

 

如果檢測的Ct<40,則表明PCR結(jié)果陽性。如果檢測的Ct≥40,則PCR反應(yīng)結(jié)果為陰性。如果FAM陽性,則支原體陽性。如果FAM陰性,HEX也陰性,表明PCR擴(kuò)增出了問題,需要重做。如果FAM陰性,HEX陽性,表明支原體確實(shí)陰性。

 

PCR擴(kuò)增出了問題主要原因?yàn)镻CR反應(yīng)被抑制了,可能需要考慮做DNA抽提。

 

在qPCR反應(yīng)中,引物和探針的設(shè)計(jì)尤為重要,它既需要覆蓋大多數(shù)支原體,又需要不與細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。當(dāng)然,Taq酶的性能也很重要,因?yàn)镈NA的擴(kuò)增終依賴于酶的活性和擴(kuò)增的速度。從這個(gè)角度說,一個(gè)好的qPCR試劑盒是各個(gè)因素共同作用的結(jié)果。

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