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培養(yǎng)中常出現(xiàn)一些黑點(diǎn),是污染嗎?

更新時(shí)間:2022-04-24  |  點(diǎn)擊率:704

現(xiàn)代生物技術(shù)一般認(rèn)為包括基因工程技術(shù)、細(xì)胞工程技術(shù)、酶工程技術(shù)和發(fā)酵工程技術(shù),而這些技術(shù)的發(fā)展幾乎都與細(xì)胞培養(yǎng)有密切關(guān)系,特別是在醫(yī)藥領(lǐng)域的發(fā)展,細(xì)胞培養(yǎng)更具有特殊的作用和價(jià)值。比如基因工程藥物或疫苗在研究生產(chǎn)過程中很多是通過細(xì)胞培養(yǎng)來實(shí)現(xiàn)的。基因工程乙肝疫苗很多是以CHO細(xì)胞作為載體;細(xì)胞工程中更是離不細(xì)胞培養(yǎng),雜交瘤單克隆抗體,*是通過細(xì)胞培養(yǎng)來實(shí)現(xiàn)的,既使是現(xiàn)在飛速發(fā)展的基因工程抗體也離不開細(xì)胞培養(yǎng)。正在倍受重視的基因治療、體細(xì)胞治療也要經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)過程才能實(shí)現(xiàn),發(fā)酵工程和酶工程有的也與細(xì)胞培養(yǎng)密切相關(guān)??傊?,細(xì)胞培養(yǎng)在整個生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展中起到了很關(guān)鍵的核心作用。

那么在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí),首先肉眼觀察培養(yǎng)液是否變渾濁,如果變渾濁,基本可以確定是污染;如果肉眼觀察培養(yǎng)液沒有變渾濁:在顯微鏡下觀察黑點(diǎn)大小和形狀是否規(guī)則,是否運(yùn)動,是做布朗運(yùn)動還是呈直線型快速移動。如果黑點(diǎn)大小不規(guī)則,做布朗運(yùn)動,黑點(diǎn)可能是細(xì)胞碎片(可能是細(xì)胞狀態(tài)不佳或者消化過度引起的),也可能是血清反復(fù)凍融產(chǎn)生的蛋白沉淀引起的,也可能是細(xì)胞的代謝產(chǎn)物。如果黑點(diǎn)大小一致,快速移動,很可能是細(xì)菌污染。

如何預(yù)防細(xì)胞培養(yǎng)中黑點(diǎn)的產(chǎn)生?

掌握細(xì)胞傳代的最佳時(shí)機(jī),不要細(xì)胞長老了再傳代;掌握好消化時(shí)間,防止消化過度產(chǎn)生細(xì)胞碎片;減少血清等試劑的凍融次數(shù);將培養(yǎng)液的PH調(diào)到最佳;嚴(yán)格控制水質(zhì)和器皿的清潔。

黑點(diǎn)已經(jīng)產(chǎn)生了,如何進(jìn)行處理?

如果判定黑點(diǎn)是污染,請及時(shí)將細(xì)胞處理后丟棄。其他情況,可參照以下進(jìn)行:

如果是懸浮細(xì)胞:收集細(xì)胞上清慢速離心(500-600 rpm/min,5-6 min)并更換新的培養(yǎng)瓶;如果是貼壁細(xì)胞:將細(xì)胞用PBS洗2-3遍,洗的時(shí)候,輕輕拍打培養(yǎng)瓶,讓貼壁不牢的碎片和顆粒脫落,再棄去PBS,消化時(shí)先加低濃度的胰酶如0.05%胰酶消化1 min左右,讓細(xì)胞間隙中的顆粒和碎片脫落下來,去掉低濃度胰酶,然后正常消化細(xì)胞,將收集的細(xì)胞懸液慢速離心(500-600 rpm/min,5-6 min)并更換新的培養(yǎng)瓶,并可以嘗試適當(dāng)增加血清濃度進(jìn)行培養(yǎng)。


支原體污染不僅是細(xì)胞培養(yǎng)中需要克服的現(xiàn)象,而且是制藥、生物制品生產(chǎn)中需要加以避免的。支原體污染的影響是什么?


支原體常規(guī)PCR法其原理和熒光定量PCR是一樣的,根據(jù)支原體核糖體的特異保守序列設(shè)計(jì)引物,對待檢樣本DNA進(jìn)行擴(kuò)增,通過對擴(kuò)增產(chǎn)物的大小分析作出判斷。

它的優(yōu)點(diǎn)是準(zhǔn)確度很高,特別是德國MB的試劑盒,不僅qPCR的靈敏度可以達(dá)到10CFU/ml以上,普通PCR的靈敏度也可以達(dá)到各國藥典的這個要求。

特異性強(qiáng),*涵蓋所有可能感染細(xì)胞的支原體物種(涵蓋歐洲藥典規(guī)定的9種支原體),根據(jù)序列一致性,至少可以檢測到107種支原體物種。與細(xì)菌和真核DNA無交叉反應(yīng)。

操作比qPCR多了個跑電泳的步驟。

時(shí)間短,2-3小時(shí)可以出結(jié)果。


唯yi的限制,因?yàn)闄z測的是支原體的DNA,所以無法區(qū)分活的支原體。但生物制品在生產(chǎn)過程中,本身不應(yīng)該產(chǎn)生支原體污染,污染過也不行,所以這個限制反而變成了優(yōu)點(diǎn)。


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