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上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)的特殊條件

更新時間:2022-04-26  |  點(diǎn)擊率:634

上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)的特殊條件

(1)防范微生物污染:

根據(jù)上皮組織分布的特性,位于體表或襯貼消化道、呼吸道內(nèi)等處的上皮組織,直接暴露或同外環(huán)境相接觸,組織本身帶有各種病原微生物或受其污染的機(jī)會較多。

要求在組織取材時就嚴(yán)格滅菌;

分離、種植、培養(yǎng)等諸多操作步驟上都要設(shè)法消除可能會出現(xiàn)的微生物污染。

培養(yǎng)中所使用的各種液體,包括細(xì)胞保存液、分離液以及培養(yǎng)基等需添加抗生素,抗生素濃度比其它組織培養(yǎng)高。

(2)生長基質(zhì)的支持:

上皮細(xì)胞依賴貼附于某種支持物上才能生長,即所謂的貼壁依賴性細(xì)胞。

在培養(yǎng)器皿表面包被生長基質(zhì),如膠原或其它細(xì)胞外基質(zhì)成分等,模擬體內(nèi)的基膜結(jié)構(gòu),不僅特別有利于上皮細(xì)胞的貼附和生長,也有利于培養(yǎng)細(xì)胞的分化.使細(xì)胞極性表現(xiàn)更為明顯。

(3)特殊的培養(yǎng)基:

培養(yǎng)基有M199、RPMl 1640、DMEM和HamFl2。

其中以M199和RPMl 1640較為常用。

M199和RPMI1640培養(yǎng)基僅適用于上皮組織的短期培養(yǎng)和維持其生存,對上皮組織的長期培養(yǎng)和促增殖作用并不明顯。

DMEM和HamFl2培養(yǎng)基用于上皮組織培養(yǎng)時有其特殊作用。

可促進(jìn)上皮細(xì)胞的貼附;

維持上皮細(xì)胞在體外培養(yǎng)狀態(tài)的分化。

HamFl2培養(yǎng)基的特殊性

特別適用原代上皮細(xì)胞的培養(yǎng),培養(yǎng)基成分中添加微量元素的無機(jī)離子,更加利于細(xì)胞的生長和代謝。

在實(shí)際培養(yǎng)時,將DMEM與HamFl2按一定比例混合用于上皮組織培養(yǎng)。

加入血清,但出廠血清成分復(fù)雜,含有一定量的有毒物和抑制物。

(4)去除成纖維細(xì)胞:

上皮組織借薄層基膜和結(jié)締組織相連。

取材分離細(xì)胞時會帶入少量結(jié)締組織成分,常常造成成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞混和生長。由于成纖維細(xì)胞具有增殖能力和粘附能力強(qiáng)的特點(diǎn),很容易“瘋長"為培養(yǎng)物中的優(yōu)勢細(xì)胞群,從而干擾或抑制上皮細(xì)胞的生長,成為上皮細(xì)胞的“細(xì)胞污染源"。

因在上皮細(xì)胞的取材、分離、種植和傳代的培養(yǎng)過程中,要特別注意上皮細(xì)胞的純化,去除和抑制成纖維細(xì)胞的生長。

內(nèi)皮細(xì)胞:

來源:人臍帶臍靜脈,動物動脈

消化:用膠原酶比胰蛋白酶消化好。

但要注意掌握消化時間和雜細(xì)胞(成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞)。

內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定

用免疫組化染色檢測VIII因子相關(guān)抗原和CD34抗原, 鑒定內(nèi)皮細(xì)胞。

觀察細(xì)胞是否呈單層貼壁生長, 細(xì)胞形態(tài),如長梭形、多角形三角形、四邊形為主, 呈典型的“鋪路石"樣征象 ;

觀察第三代細(xì)胞純度是否達(dá)95%以上。

如消化時間過長或操作不慎、刮取過重時,會造成血管內(nèi)皮下層與外膜成纖維細(xì)胞以及中膜平滑肌細(xì)胞污染。由于這些雜細(xì)胞生長較快,隨著傳代次數(shù)越多,其污染的程度越重,從而使培養(yǎng)失敗。

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