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都是qPCR,結(jié)果為何差距這么大?

更新時(shí)間:2023-03-25  |  點(diǎn)擊率:739

qPCR技術(shù)是分子生物實(shí)驗(yàn)中,常見的一種幾首手段。使用Quantitative Real Time PCR擴(kuò)增裝置即qPCR儀,通過不同的化學(xué)原理和數(shù)學(xué)原理,在PCR過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的技術(shù)。qPCR實(shí)現(xiàn)了通過Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對起始模板進(jìn)行定量分析。

qPCR的熒光標(biāo)記方法分為以添加熒光基團(tuán)核酸探針為主的熒光探針法,以綠色染料為主的熒光染料嵌合法。


利用不同化學(xué)原理設(shè)計(jì)的qPCR實(shí)驗(yàn),

實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能會產(chǎn)生不小的差距!

本期內(nèi)容,我們一起來聊聊這兩種常見的qPCR熒光標(biāo)記方法有何不同,幫助大家選擇更符合自身實(shí)驗(yàn)需求的方法。


熒光探針法

簡單來說,應(yīng)用該原理的熒光探針,是由熒光基團(tuán)+DNA寡核苷酸+淬滅基團(tuán)構(gòu)成。

探針由5’端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)、目標(biāo)基因特異性結(jié)合的寡核苷酸序列以及3’端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)以及與組成。

自然狀態(tài)下,探針完整,熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收,儀器不會檢測到熒光信號。

當(dāng)存在目標(biāo)序列時(shí),目標(biāo)DNA變性解鏈,熒光探針特異性結(jié)合到目標(biāo)基因處。引物也結(jié)合在目標(biāo)基因上,Taq酶又名DNA聚合酶,能將核苷酸添加到引物中,引物開始延伸。

Taq酶還具有5’-3’核酸外切酶活性。當(dāng)引物延伸至探針結(jié)合處,可將探針?biāo)?,使熒光?bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離,進(jìn)而被qPCR儀檢測到熒光信號,熒光信號的強(qiáng)度與擴(kuò)增得到的DNA的濃度成正比。

熒光信號被儀器檢測并采集得到“擴(kuò)增曲線",通過熒光信號的強(qiáng)度反映出體系中雙鏈DNA的濃度。

熒光探針有許多不同種類,以應(yīng)對不同的實(shí)驗(yàn)需求,該方法特異性高,已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于基因檢測、病原體和病毒檢測、疾病耐藥基因篩查等領(lǐng)域。


德國MB支原體檢測試劑盒

Venor®Gem qEP

應(yīng)用熒光探針法對支原體DNA進(jìn)行檢測,準(zhǔn)確率高,使用方便。

熒光染料嵌合法

該方法用到一種非特異性雙鏈DNA熒光染料,被激發(fā)后,顯示為綠色熒光。

該染料以一種非特異性方式,與雙鏈DNA(dsDNA)雙螺旋小溝區(qū)域相結(jié)合。游離的染料熒光信號微弱,在進(jìn)行qPCR擴(kuò)增生成dsDNA時(shí),染料逐漸與dsDNA結(jié)合,熒光信號被很大程度放大,熒光信號的強(qiáng)度與擴(kuò)增得到的dsDNA的濃度成正比。

熒光信號被儀器檢測并采集得到“擴(kuò)增曲線",通過熒光信號的強(qiáng)度反映出體系中dsDNA的濃度。

德國MB支原體qPCR檢測試劑盒,應(yīng)用熒光探針法原理,對支原體DNA進(jìn)行檢測,具有特異性更強(qiáng)、靈敏度更高、可重復(fù)性更佳的特點(diǎn)。

支原體檢測方面,通過歐洲藥典和日本藥典方法學(xué)檢驗(yàn)。



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