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如何測定轉(zhuǎn)導細胞中的載體拷貝數(shù)(VCN)

更新時間:2024-07-28  |  點擊率:575

在基因治療和細胞療法中,特別是CAR-T細胞療法和TCR-T細胞療法,載體拷貝數(shù)(Vector Copy Number, VCN)是一個至關重要的參數(shù)。它直接關系到細胞治療產(chǎn)品的安全性和有效性。VCN指的是外源基因載體整合到宿主細胞基因組中的拷貝數(shù),過高的VCN可能會增加致癌風險,而過低的VCN則可能影響基因表達效率。因此,準確測定轉(zhuǎn)導細胞中的VCN對于細胞治療產(chǎn)品的質(zhì)量控制和臨床應用具有重要意義。本文將詳細介紹幾種常用的測定VCN的方法及其優(yōu)缺點。

常用的VCN測定方法

1. 定量聚合酶鏈反應(qPCR

定量聚合酶鏈反應(qPCR)是目前測定VCN常用的方法之一。該方法通過提取轉(zhuǎn)導細胞的基因組DNAgDNA)作為模板,設計特異性引物和探針,針對目的基因和參考基因(通常為單拷貝基因)進行實時熒光PCR擴增。通過標準曲線法或絕對定量法,可以計算出每單位DNA中目的基因的拷貝數(shù),進而推算出每個細胞中的載體拷貝數(shù)。

優(yōu)點:

  • 靈敏度高,能夠檢測到極低的拷貝數(shù)。

  • 操作簡便,成本相對較低。

  • 可用于大規(guī)模樣本的檢測。

缺點:

  • 需要生成標準曲線,且標準曲線的準確性和穩(wěn)定性直接影響結(jié)果。

  • 精度較低,特別是在低拷貝數(shù)情況下。

  • 可能存在競爭性抑制問題,影響多重PCR的準確性。

2. 數(shù)字PCRdPCR

數(shù)字PCR是一種絕對定量的PCR方法,它將含有目標序列的反應溶液分配到大量獨立的反應室中,每個反應室只包含少量模板DNA分子。通過PCR擴增后,計算陽性反應室的比例,并根據(jù)泊松分布進行校正,從而實現(xiàn)目標核酸序列的絕對定量。

優(yōu)點:

  • 不需要標準曲線,結(jié)果更為準確可靠。

  • 靈敏度和精度均高于qPCR,特別是在低拷貝數(shù)情況下。

  • 可用于多重檢測,減少操作誤差。

缺點:

  • 成本較高,設備昂貴。

  • 操作復雜,對實驗人員的技術要求較高。

3. Tapestri® VCN Assay

Tapestri® VCN Assay是近年來推出的一種高通量單細胞檢測方法,能夠在單個細胞水平上對VCN進行準確定量。該方法結(jié)合了單細胞DNA分析和多組學技術,能夠在一次檢測中同時獲取數(shù)千個單個工程化改造后細胞內(nèi)的VCN和轉(zhuǎn)導效率信息。

優(yōu)點:

  • 高通量,能夠在單個細胞水平上進行檢測。

  • 準確度高,能夠揭示細胞間的VCN差異。

  • 可縮短表征周期,減少樣本用量。

缺點:

  • 技術較新,普及程度不高。

  • 設備昂貴,操作復雜。

實驗步驟與注意事項

實驗步驟

  1. 樣本準備:收集轉(zhuǎn)導后的細胞,提取基因組DNA。

  2. 引物與探針設計:根據(jù)目的基因和參考基因設計特異性引物和探針。

  3. 標準曲線構(gòu)建(如采用qPCR方法):將編碼目的基因的質(zhì)粒進行連續(xù)稀釋,構(gòu)建標準曲線。

  4. PCR擴增:根據(jù)所選方法(qPCR、dPCRTapestri® VCN Assay)進行PCR擴增。

  5. 數(shù)據(jù)分析:根據(jù)擴增結(jié)果計算VCN。

注意事項

  1. 樣本質(zhì)量:確保提取的基因組DNA質(zhì)量良好,無降解和污染。

  2. 引物與探針設計:引物和探針應具有高度的特異性和敏感性,避免非特異性擴增。

  3. 標準曲線構(gòu)建:標準曲線的準確性和穩(wěn)定性對結(jié)果影響重大,需嚴格控制實驗條件。

  4. 操作規(guī)范:嚴格按照實驗操作規(guī)程進行,避免操作誤差。

結(jié)論

準確測定轉(zhuǎn)導細胞中的載體拷貝數(shù)(VCN)對于細胞治療產(chǎn)品的質(zhì)量控制和臨床應用具有重要意義。目前常用的測定方法包括qPCR、dPCR等,每種方法都有其優(yōu)缺點。實驗人員應根據(jù)具體需求和實驗條件選擇合適的方法,并嚴格按照操作規(guī)程進行實驗,以確保結(jié)果的準確性和可靠性。隨著技術的不斷發(fā)展,未來可能會有更多更準確、更便捷的方法出現(xiàn),為細胞治療產(chǎn)品的質(zhì)量控制和臨床應用提供有力支持。


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