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dPCR和qPCR之間的區(qū)別是什么?

更新時(shí)間:2024-11-02  |  點(diǎn)擊率:370

dPCR(數(shù)字PCR)和qPCR(實(shí)時(shí)熒光定量PCR)是兩種在分子生物學(xué)研究中廣泛使用的核酸定量技術(shù),它們之間存在一些顯著的區(qū)別。以下是對(duì)這兩種技術(shù)的詳細(xì)比較:

一、檢測(cè)原理

  1. qPCR

    • 主要使用插入染料(如SYBR Green)或熒光探針(如TaqMan)來監(jiān)測(cè)整個(gè)擴(kuò)增過程。

    • 隨著PCR循環(huán)的進(jìn)行,染料或探針的熒光強(qiáng)度逐漸增加,從而可以檢測(cè)到定量反應(yīng)的DNA。

    • qPCR依賴于標(biāo)準(zhǔn)品制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定未知樣品的濃度,因此是一種相對(duì)定量的方法。

  2. dPCR

    • 將一個(gè)樣本分成大量的微小反應(yīng)單元(通常是微滴或微孔),每個(gè)單元包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的核酸分子。

    • 每個(gè)單元都進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)強(qiáng)度。

    • 根據(jù)泊松分布原理以及陽性反應(yīng)單元的比例,可以計(jì)算出起始模板DNA的濃度,因此dPCR是一種絕對(duì)定量的方法。

二、檢測(cè)流程

  1. qPCR

    • 包括DNA提取、配置qPCR反應(yīng)體系、加入DNA模板、設(shè)置反應(yīng)條件及PCR擴(kuò)增、讀取結(jié)果等步驟。

    • 通常需要使用標(biāo)準(zhǔn)品生成標(biāo)準(zhǔn)曲線,以進(jìn)行未知樣品的定量。

  2. dPCR

    • 檢測(cè)流程與qPCR類似,但更強(qiáng)調(diào)樣本的精確分割和反應(yīng)單元的獨(dú)立性。

    • 包括DNA提取、濃度檢測(cè)并稀釋、配置PCR反應(yīng)液、上機(jī)檢測(cè)、PCR擴(kuò)增和結(jié)果判讀等步驟。

    • dPCR的結(jié)果判讀通常依賴于對(duì)每個(gè)微小反應(yīng)單元的熒光信號(hào)檢測(cè),以及基于泊松分布的統(tǒng)計(jì)分析。

三、技術(shù)優(yōu)勢(shì)與特點(diǎn)

  1. qPCR

    • 具有高度的敏感性和特異性,能夠?qū)崿F(xiàn)多重反應(yīng)和自動(dòng)化檢測(cè)。

    • 實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)模式功能強(qiáng)大,具備定性、定量、突變檢測(cè)等多種功能。

    • 技術(shù)成熟,有大量商業(yè)化產(chǎn)品可供選擇,且價(jià)格相對(duì)較低。

    • 更適合高通量分析,動(dòng)態(tài)范圍寬。

  2. dPCR

    • 準(zhǔn)確度與精密度高,較少受到擴(kuò)增效率的影響。

    • 絕對(duì)定量,不需要標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)準(zhǔn)曲線,直接計(jì)算樣品中目的核酸分子的個(gè)數(shù)。

    • 抗干擾能力強(qiáng),對(duì)抑制劑的抵抗能力高,適用于復(fù)雜樣本的檢測(cè)。

    • 在微小差異面前表現(xiàn)優(yōu)秀,能夠鑒別差異小于20%的拷貝數(shù)。

四、應(yīng)用場(chǎng)景

  1. qPCR

    • 廣泛應(yīng)用于病原體檢測(cè)、基因表達(dá)分析、遺傳病診斷等領(lǐng)域。

    • 在高通量篩選和大規(guī)模實(shí)驗(yàn)中具有優(yōu)勢(shì)。

  2. dPCR

    • 適用于需要高精度和高靈敏度的實(shí)驗(yàn),如稀有突變檢測(cè)、基因拷貝數(shù)變異分析、無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)(NIPT)等。

    • 在復(fù)雜樣本和抑制劑存在的情況下表現(xiàn)出色。

 

dPCRqPCR在檢測(cè)原理、檢測(cè)流程、技術(shù)優(yōu)勢(shì)與應(yīng)用場(chǎng)景等方面存在顯著差異。研究人員應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求、樣本類型和實(shí)驗(yàn)條件等因素,選擇合適的技術(shù)進(jìn)行核酸定量研究。

 


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