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細(xì)胞培養(yǎng)之懸浮細(xì)胞培養(yǎng)

更新時(shí)間:2022-04-15  |  點(diǎn)擊率:714

材料與儀器

凍存 HeLa S3 細(xì)胞
70% 乙醇 * MEM-10 胰酶/EDTA
旋轉(zhuǎn)瓶*培養(yǎng)基-5 25 cm2 組織培養(yǎng)瓶 C02 培養(yǎng)箱 Sorvall H-6000A 轉(zhuǎn)子 100 ml 或 200 ml 通氣旋轉(zhuǎn)瓶和帶濾膜的瓶蓋

步驟

1. 將含有凍存 HeLa S3 細(xì)胞的安瓿放入 37℃ 水浴中解凍。

2. 用 70% 乙醇對(duì)安瓿的頂端進(jìn)行消毒,打開安瓿,用吸管將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有 5 ml * MEM-10 培養(yǎng)基的 25 cm2 組織培養(yǎng)瓶中,輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶,使細(xì)胞均勻分布于培養(yǎng)瓶中,放入 5% CO2 加濕培養(yǎng)箱中 37℃ 培養(yǎng)過夜。

3. 將培養(yǎng)基吸出,用 0.5 ml 37℃ 的胰酶/EDTA 覆蓋細(xì)胞,消化 30~40 s。

4. 加入 10 ml 旋轉(zhuǎn)瓶*培養(yǎng)基-5,并將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至 50 ml 的離心管中。室溫 1800 g 離心 5 min,棄上清。

5. 將細(xì)胞沉淀懸浮在 5 ml 的旋轉(zhuǎn)瓶*培養(yǎng)基-5 中,上下吹打,將細(xì)胞團(tuán)打散。

6. 在 100 ml 或 200 ml 通氣旋轉(zhuǎn)瓶中加入 50 ml 旋轉(zhuǎn)瓶*培養(yǎng)基-5,并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到瓶中。

7. 取出 1 ml 細(xì)胞懸液,用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器(附錄 3F) 進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。加入適量的旋轉(zhuǎn)瓶*培養(yǎng)基-5,使細(xì)胞密度為(3~4)× 105 細(xì)胞/ml。將細(xì)胞放入無 CO2 培養(yǎng)箱,37℃ 旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。

8. 隨后的兩天讓細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng),并且每天對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),加入適量的旋轉(zhuǎn)瓶*培養(yǎng)基-5 以維持(3~4)×105 細(xì)胞/ml 的細(xì)胞密度。

9. 取 1 ml 的細(xì)胞懸液,用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器對(duì)細(xì)胞進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

10. 當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到(4~5)×105 細(xì)胞/ml 時(shí),隔天或每天用培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至 1.5×105 或 2.5×105 細(xì)胞/ml。

11. 分別將裝有 50 ml 或 100 ml 細(xì)胞懸液的 100 ml 或 200 ml 通氣旋轉(zhuǎn)瓶放入 37℃ 無 CO2 培養(yǎng)箱旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。每天或隔天傳代。


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